ABSTRACT
Immunoglobulins isolated from egg yolk (IgY) are tools which are currently used in different fields of the biological sciences; they have clear advantages over mammalian serum IgGs. We have established the conditions for obtaining anti-Salvia bogotensis lectin IgYs in previous work; their use in immunocytochemical studies requires that their main molecular characteristics are known as well as the conditions for IgY-lectin interaction. Salvia bogotensis lectin (SBoL) can specifically recognise Tn antigen, a recognised tumoral marker in many types of cancer but additional tools are required for evidencing this interaction in cells. Given the availability of S. bogotensis anti-lectin IgY, this work was aimed at molecularly characterising these IgYs and evaluating their application in immunocytochemical studies for detecting Tn antigen in tumour cells. Purified IgYs' isoelectric points, molecular weight and carbohydrate content were determined. Homologous and heterologous lectins were obtained for establishing the specificity of antibody interaction with the lectin; they were assayed by ELLSA. Biotin-or peroxidase-labelled IgYs were prepared; Tn antigen was specifically detected by CELISA and immunocytochemistry in MCF-7 and HeLa cell-lines with the lectin which was revealed with the labelled IgYs. Results showed that anti-SBoL IgY antibodies represent a highly sensitive tool for specific Tn antigen recognition assays.
Las inmunoglobulinas aisladas de la yema de huevo (IgY) son muy utilizadas actualmente en diversos campos de las ciencias biológicas, dadas sus ventajas frente a las IgG séricas de mamíferos. En un trabajo previo establecimos las condiciones de obtención de IgY dirigidas contra la lectina de Salvia bogotensis; su utilización en estudios inmunocitoquímicos requiere conocer sus principales características moleculares y las condiciones para la interacción IgY-lectina. La lectina de Salvia bogotensis (SBoL) reconoce específicamente el antígeno Tn, marcador tumoral en muchos tipos de cáncer, pero se requieren herramientas adicionales para evidenciar esta interacción a nivel celular. Dada la disponibilidad de IgY anti-lectina de S. bogotensis, se realizó este trabajo con el objeto de caracterizar molecularmente estas IgY y evaluar su utilización en estudios inmunocitoquímicos para la detección del antígeno Tn en células tumorales. A las IgY purificadas se les determinó su punto isoeléctrico, peso molecular y contenido de carbohidratos. Para establecer la especificidad de interacción IgY-SBoL se obtuvieron lectinas homólogas y heterólogas y se ensayaron por ELLSA. La detección del antígeno Tn en las líneas celulares MCF-7 y HeLa con la lectina y las IgYs marcadas con biotina o peroxidasa se realizó por CELISA e inmunocitoquímica. Los resultados mostraron que los anticuerpos IgY anti-SBoL son una herramienta de una alta sensibilidad para los ensayos de reconocimiento específico del antígeno Tn.
Imunoglobulinas isoladas a partir de gema de ovo (IgY) são ferramentas utilizadas actualmente em diferentes áreas das ciências biológicas y apresentam vantagens claras sobre o soro de mamífero IgGs. Em investigações anteriores estabelecemos as condições para obter lectina IgYs anti-Salvia bogotensis. O seu uso em estudos imunocitoquímicos requer que as suas principais características moleculares sejam conhecidas, assim como as condições para a interacção IgY-lectina. A lectina de Salvia bogotensis (SBoL) pode reconhecer especificamente o anti-génio Tn, um reconhecido marcador tumoral em muitos tipos de cancro, mas novas ferramentas são necessárias para evidenciar esta interacção em células. Dada a disponibilidade de anti-lectina IgY de S. bogotensis, este trabalho teve como objectivo a caracterização molecular de estes IgYs e avaliar a sua aplicação em estudos imunocitoquímicos para detectar antigénio Tn em células tumorais. Foram determinados os pontos isoeléctricos, peso molecular e conteúdo de carbohidratos de IgYs purificadas. Lectinas homologas e heterologas foram obtidas para estabelecer a especificidade da interacção de anticorpo com a lectina; estes foram ensaiados por ELLSA. Foram preparados IgYs marcados com biotina ou peroxidase. O antigénio Tn foi detectado especificamente por CELISA e imunocitoquimica em linhas celulares MCF-7 y HeLa com lectina que foi revelada com as IgYs marcadas. Os resultados mostraram que os anticorpos anti-SBoL IgY representam uma ferramenta altamente especifica para ensaios de reconhecimento especifico de antigenio Tn.
ABSTRACT
Introducción. Las inmunoglobulinas presentes en la yema de huevo de gallina (IgY) han sido ampliamente utilizadas en inmunología, bioquímica, biotecnología y salud humana y animal. Aunque presentan una serie de ventajas frente a las IgG de mamíferos, su aislamiento requiere, por una parte, la eliminación de los lípidos presentes en la yema del huevo sin alterar su funcionalidad y, por otra, la utilización de metodologías de purificación que permitan una recuperación tal que haga factible su empleo como herramientas de detección y purificación a una escala significativa. Objetivo. Dado el interés que presenta el antígeno Tn como marcador tumoral en muchos tipos de cáncer, y la capacidad que tiene la lectina aislada de semillas de Salvia bogotensis para reconocer específicamente este antígeno, se adelantó el presente trabajo con la meta de disponer de IgY anti-lectina para emplearla en estudios inmunohistoquímicos y de biología celular. Materiales y métodos. Se produjo IgY anti-lectina inmunizando gallinas con lectina de S. bogotensis y se evaluó la respuesta inmune en función de la dosis y del tiempo; se ensayaron varios métodos de remoción de lípidos y de extracción y se compararon los rendimientos y la pureza de IgY obtenidas con varios métodos de purificación. Resultados. El mejor método de delipidación y extracción de IgY requiere dilución con agua, acidificación del extracto y precipitación con (NH4)2SO4 60 por cientos, recuperándose 43,35 mg de proteína/yema. La cromatografía tiofílica permite obtener las IgY puras en buena cantidad (10,4 mg/yema), preservando la funcionalidad y características de estos anticuerpos. Conclusión. Se establecieron las mejores condiciones para extraer y purificar IgY funcionales dirigidas contra la lectina de S. bogotensis